ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ УСЛОВИЙ НА СПЕРМИИ ВНЕ ОРГАНИЗМА
1. Влияние температуры
Лучше всего спермии сохраняются при t от 0 до 15ºС. Более низкая и особенно высокая t губительна для них. Если спермии поместить в среду с t = 5ºС, они делаются малоподвижными или даже обездвиженными. При подогревании спермы до 10ºС их двигательная активность увеличивается, и по мере повышения t возрастает вплоть до 38 -40ºС – это максимум.
Если температуру повысить больше 40ºС, срок жизни спермиев значительно укорачивается. Известно, что уже при t = 46,5ºС часть белков необратимо денатурирует.
Менее вредными для спермиев считаются низкие температуры. При постепенном охлаждении можно довести спермии до состояния замораживания, а затем, после подогревания восстановить активность и оплодотворяющую способность. Резкое или скачкообразное охлаждение после высоких температур могут вызвать у спермиев температурный шок, который выражается потерей способности оживать (полная гибель) либо принятие уродливых форм спермиев. Особенно легко возникает температурный шок при охлаждении только что полученной спермы - ниже 18 ºС, поэтому в помещениях для взятия спермы рекомендуется определенный температурный режим. (18-20 ºС).
Тогда совершенно правильно возникает вопрос: «Почему же спермии не погибают при t жидкого азота -196ºС»
Ответ на это вопрос кроется в двух формах замерзания:
1)замерзание с интенсивной кристаллизацией цитоплазмы - плавное, тогда клетка погибает;
2)замерзание цитоплазмы по типу стекловидного (без кристаллов) затвердевания – быстрое, тогда клетка остается живой.
В результате замораживания спермиев в жидком азоте фазу кристаллизации удается «проскочить» миновать.
Реакцию спермиев на температуру следует расценивать как их приспособление в процессе эволюции. Изначально они находятся в придатке семенника в состоянии анабиоза (на 4ºС ниже), а когда попадают в половой аппарат самки быстро активируются и включаются в процесс продвижения и оплодотворения.
2. Влияние света
Считается, что рассеянный дневной свет не воздействует вредно на спермиев. А вот под влиянием прямых солнечных лучей движение спермиев сначала увеличивается, а потом в течение 20 минут они погибают. Отрицательное действие обусловлено влиянием ультрафиолета и инфракрасного излучения. Поэтому, при искусственном осеменении спермии оберегают от лучей солнца и бактерицидных ламп. Последние действуют губительно на микрофлору, и, также само, инактивируют спермии.
3. Влияние осмотического давления
Находясь в эякуляте, спермии легко поддаются воздействию ее сыворотки. В свою очередь они сами могут изменять химический состав спермы пополняя ее продуктами своей жизнедеятельности. По этой причине величина осмотического давления не постоянна ( у быка 4,8-9,1 атм.).
Спермии очень чувствительны к осмотическому давлению. Если спермии поместить в гипотонический раствор или обыкновенную воду, они быстро погибают в результате повышения внутреннего давления. Под влиянием гипотонического раствора хвосты спермиев набухают и закручиваются кольцом.
Если спермии смешать с гипертоническим раствором, то оно погибнут от обезвоживания. Они сморщиваются, их хвосты приобретают зигзагообразную форму.
Благоприятным для спермиев является только изотонические растворы. Поэтому при приготовлении растворов для искусственного осеменения нужно следить, чтобы сперма не контактировала с водой (в виде конденсата, паров стерилизатора и т.д)
4. Влияние реакции среды
Активность, переживаемость и уровень обмена веществ спермиев во многом зависит от концентрации ионов водорода.
Благоприятной для спермы
-быка рН = 6,9-7,0
-барана рН =7,0-7,2
-хряка рН = 7,2-7,5
-петуха рН = 7,2
-кролика рН =6,8
В кислой (рН < 6) и сильно щелочной (рН > 7,5) реакции спермии погибают. Под влиянием органических кислот (молочной, уксусной, янтарной, масляной) движение спермиев прекращается даже при небольшой концентрации. Неорганические кислоты (соляная, серная, фосфорная), наоборот даже в небольших концентрациях не влияют отрицательно на спермиев.
Разность воздействия органических и неорганических кислот объясняется неспособностью свободных ионов проникать через оболочку в клетку. Неорганические кислоты полностью диссоциируют на ионы в растворах, тогда как органические содержат часть молекул не распавшихся на ионы. Соответственно молекулы органических кислот проникают в клетку и распадаясь в цитоплазме подкисляют ее.
5. Влияние химических веществ
Несмотря на все правила асептики в практике искусственного осеменения полученная сперма всегда более или менее загрязнена бактериальной флорой. Стремление специалистов найти такое дезинфицирующее средство, которое могло бы действовать на бактерицидно на микрофлору, не влияя отрицательно на спермиев не увенчались успехом. Исследования показали, что ни одно из современных дезинфицирующих веществ не может считаться безвредным для спермиев.
Установлено, что спермиев быстро убивают перманганат калия уже в дозе 4*10-5, лизол, креолин, уксусная кислота в дозе 3*10-4 на1 г спермы. Сильными ядами для спермиев являются эфир, нашатырный спирт, скипидар.
Токсичным для спермиев могут быть также резиновые камеры, дистиллированная вода, полиэтиленовые приборы. Поэтому все приборы для искусственного осеменения требуют биологической оценки до использования для животных.
Несмотря на то, что в принципе при искусственном осеменении противопоказано применение дезинфицирующих средств – для обеззараживания пользуются ими.
Наиболее приемлем для этого этиловый спирт. По сравнению с другими средствами он легко удаляется с инструментов (испаряется). Однако нужно помнить, что 0,5% этанол моментально убивает спермии. Спирт-сырец также губителен из-за примесей (сивушные масла) для спермы поэтому используют только ректификат.
6. Влияние микробной и грибковой загрязненности
Уже давно найдена прямая связь между степенью микробной, грибковой загрязненностью, качеством спермы и оплодотворяющей способностью. Принято считать, что изначально в извитых канальцах, придатке, спермопроводах стерильная среда. Инфицирование спермиев происходит в мочеполовом канале и после соприкосновения с воздухом. Количественный и качественный состав микрофлоры спермы в значительной степени зависят от здоровья производителя, условий внутри вагины, манежа, лаборатории.
Самое большое количество микроорганизмов отмечается в воздухе помещения. В плохих гигиенических условиях 1 см3 воздуха находят до 1,6 млн микрооргнизмов.
У хряков одним из источников сильного загрязнения спермы является дивертикул препуция (слепой мешок).
Сперма-это хорошая питательная среда для сохранения и размножения многих патогенных и непатогенных микроорганизмов. При этом не антибиотики, не низкая температура не уменьшают количество микробных тел и не обеспечивают обеззараживания спермы. В видовом отношении микрофлору в сперме подразделяют на 4 группы: сапрофитная, патогенная, условно-патогенная, протозои и риккетсии. Из условно патогенной микрофлоры наиболее патогенной является синегнойная палочка. Но кроме этого присутствует кишечная палочка, стафилококки, стрептококки, протей.
Наряду с бактериями в разбавленной и свежей сперме встречаются грибы с патогенными и токсическими свойствами (Candida, Aspergillus и др), которые обуславливают возникновение абортов и эндометрита. Микробы, попавшие в сперму в основном располагаются около спермиев или на спермиях (адгезивные свойства). При воздействии микробов происходит набухание и распад колпачка головки и всей оболочки спермия.
Для осеменения допускают сперму с содержанием в 1 мл не более 5 тыс. микробных клеток и при отсутствии патогенной микрофлоры и синегнойной палочки.
Свежая неразбавленная сперма производителя должна иметь колититр (наименьшее количество исследуемого материала, в котором содержится одна кишечная палочка) не более 1:10 мл.
ХРАНЕНИЕ СПЕРМЫ
Благодаря открытию переживаемости спермы при низких температурах, оказалось ее можно хранить несколько лет и даже десятилетий, перевозить на любые расстояния, а, главное, всегда иметь на станциях сперму лучших производителей.
Биология заморозки. При температурах выше 0ºС обменные процессы в сперме хотя и замедляются, но не прекращаются. Продолжается накопление вредных продуктов распада и начинается процесс разрушения передней части головки спермия - акросомы, которая выполняет важную функцию при оплодотворении яйцеклеток.
Удлинить сроки хранения спермы можно путем еще большего замедления обменных процессов, для чего необходимо охладить ее до отрицательных температур. Но уже при -0,6ºС сперма начинает замерзать. Основная причина ее гибели – кристаллическое замерзание воды. Если сперму охлаждать медленно, то вся вода, содержащаяся в ней, успеет превратиться в ледяные кристаллы и спермии погибнут. При быстром охлаждении удается «миновать» зону кристаллизации и достичь зоны витрификации, где протоплазма спермиев затвердевает как единое целое без вымерзания воды и образования кристаллов льда. Глубокое охлаждение спермы до температуры жидкого азота достигается в течение нескольких минут.
Замораживание спермы быка. Для замораживания в жидком азоте пригодна сперма с концентрацией спермиев не менее 0,8 млрд/мл и активностью не ниже 8 баллов.
Заморозка на фторопластовых пластинах в форме гранул.
После получения и оценки сперму разбавляют лактозо (11,5 мл) – желточной (20 мл) средой с глицерином (5 мл). Сперму разбавляют в 10-30 раз в зависимости от объема гранул.
Если объем гранул 0,1-0,2 мл, то необходимы меньше степени разбавления и тогда на пункте искусственного осеменении сперму перед использованием надо разбавить: для этого гранулы размораживают во флаконе до 38-40ºС. Сперму, предназначенную для размораживания в гранулах объемом 0,5 мл, разбавляют в 10 раз и больше и перед осеменением коров две гранулы помещают в стерильный флакон и погружают его в теплую воду (38-40ºС).
Заморозка необлицованных гранул .Разбавленную сперму охлаждают до 2-5ºС в течение 3-4 часов, а затем разливают градуированными пипетками, полиэтиленовым шприцем или разливочной машиной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопластовой пластины. Пластину выдерживают над жидким азотом на расстоянии 5-10 см в течение 1,5-2 мин, а затем погружают е в жидкий азот на 1-2 мин. После замораживания спермы пластину вынимают из жидкого азота, гранула собирают сачком и пересыпают в охлажденный контейнер, который помещают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением из чашек пинцетом достают охлажденные до -196ºС гранулы, размораживают их. Оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности не ниже 4 баллов.
Заморозка облицованных гранул. (по Осташко) замораживают сперму, разбавленную средами №1 и 2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые флаконы по 200-400 мл, которые подсоединяют к специальному устройству для разбавления. Сперму сначала разбавляют средой №1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре 5-10 минут, затем средой №2 до требуемой концентрации (15 млн в 1 дозе).
Сперму разбавляют с помощью устройства благодаря которому можно дозировано вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермоприемника со спермой. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на дозы 0,25-0,33 мл и герметизируют путем термической сварки. Облицованные гранулы помещают в алюминиевые тубы и оставляют в холодильнике (2-5ºС) в течение 4-6 часов для эквилибрации. Затем обоймы с тубами в сосуд Дьюара. Активность спермиев после замораживания спермы проверяют через 24 часа. Из каждой тубы берут гранулу и размораживают при t 40ºС. Упаковку протирают и определяют активность (между стеклами). Для дальнейшего хранения в жидком азоте допускается сперма с активностью не ниже 4 баллов.
Заморозка в полипропиленовых трубочках, или соломинках (пайетах) происходит предварительно разбавленной спермой так, чтобы после разморозки в соломинке было не менее 15 млн подвижных спермиев. Каждую соломинку маркируют: указывают наименование предприятия, кличку и номер быка, дату получения спермы. Разбавленную сперму расфасовывают по 0,25 мл с помощью машины, которая автоматически заполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками (синие пробки). Один шарик служит пробкой-поршнем, а другой герметизирует соломинку.
Штативы с соломинками кладут в пластмассовые коробки, которые переносят в холодильник и выдерживают при 4ºС в течение 3-4 часов. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и к замораживанию допускается сперма с активностью не ниже 8 баллов. Сперму в соломинках хранят в пластмассовых стаканах на 500 и 150 доз в жидком азоте.
Замораживание спермы жеребца.
Перед замораживанием сперму жеребца разбавляют в 4 раза лактозо-желато-цитратно-желточной или лактозо-желточно-сульфатной средой. Разбавленную сперму разливают по 25 мл в охлажденные алюминиевые пакеты, плотно закрывают и замораживают в парах над жидким азотом на пенопластовом поплавке на расстоянии 1-2 смот поверхности в течение 5-7 мин, а затем пакеты. А затем пакеты переносят в жидкий азот. При замораживании спермы в виде гранул ее наносят по 0,2 мл в лунки плашки помещенной на сухой лед. Через 5 мин замороженные гранулы собирают, упаковывают в алюминиевые тубы или пластмассовые стаканы и помещают на хранение в сосуд с жидким азотом.
Сперму хряков разбавленную желатными средами сохраняют до 3 суток при t 16-20 ºС в термосах-ящиках или бытовых сумках-холодильниках.
Сперму баранов жеребцов и быков хранят также при t 2-5 ºС в холодильниках, пищевых широкогорлых термосах. Загруженных тающим льдом.
Правила техники безопасности при работе с жидким азотом
Для того чтобы предупредить травматизм при использовании сосудов Дьюара, работать нужно в защитных очках, кожаных рукавицах или перчатках. Попадание жидкого азота на незащищенные участи кожи вызывает ожог (обморожение). Попавший на открытый участок тела жидкий азот надо немедленно смыть водой.
Строго запрещается, заливать азот в неохлажденный сосуд, заглядывая в горловину. При этом может произойти выброс жидкого азота. Повышенная концентрация азота в воздухе вызывает головную боль, головокружение и даже потерю сознания. Поэтому помещение, где хранят жидкий азот, оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией. Если пострадавший в обморочном состоянии его немедленно выносят на свежий воздух. Во время эксплуатации сосуда Дьюара нельзя плотно закрывать его горловину, т.к. при испарении жидкого азота и прекращении его выхода в атмосферу будет создаваться повышенное давление внутри сосуда и он может взорваться.
При транспортировке сосуды с жидким азотом необходимо хорошо закреплять, чтобы избежать их падения и возможного взрыва. Сосуды, предназначенные для перевозки авиатранспортом, заливают жидким азотом на половину гидравлической емкости. Чтобы предотвратить накопление взрывоопасной смеси в сосуде от обогащения жидкого азота кислородом, содержание последнего контролируют с помощью переносного газоанализатора ГХП-3. Анализ необходим в хранилище 1 раз в год, а в сосудах на пунктах 1 раз в 6 мес. Если содержание кислорода достигло 15%, сосуд опорожняют в месте, очищенном от предметов органического происхождения.
ТРАНСПОРТИРОВКА СПЕРМЫ
Для того, чтобы перевезти сперму используют сосуды Дьюара и термосы различной конструкции. Когда перевозки осуществляются в жидком азоте применяют специальные стальные двустенные сосуды на 4-50 л. Суточный расход жидкого азота в них колеблется от 5 до 10% в зависимости от размеров сосуда. Во время транспортировки замороженной спермы самое главное - постоянно поддерживать низкую температуру.
При получении сосуда с замороженной спермой, в хозяйстве прежде всего выясняют, достаточно ли в сосуде хладагента, т.е покрыты ли ампулы сверху. Хранить сперму без хладагента нельзя. Она может быстро потерять оплодотворяющую способность. По этой же причине размороженную сперму можно использовать только в ближайшие часы.
Если в хозяйстве на пункте искусственного осеменения есть сосуд с жидким азотом, где хранится замороженная сперма, то кассеты или канистры с гранулами, пакеты со спермой в капиллярах-соломинках, быстро переносят из одного сосуда в другой, соблюдая технику безопасности.
Транспортировка спермы. Обычно со станции искусственного осеменения сперму производителей доставляют на пункты автотранспортом, но нередко используют авиа и железнодорожный транспорт. Основные правила при перевозке спермы: предохранить термосы и сосуды от тряски, не допускать их повреждения и нарушения температурного режима. Сперму важно доставлять в возможно короткие сроки. Вместе со спермой в хозяйство направляют в двух экземплярах ордер (один возвращают на станцию), в котором указывают качество спермы.
В хозяйстве для перевозки спермы производителей и хранения ее на пунктах при 0-4 и 5-20ºС используют термосы разной конструкции (термосы-ящики, бытовые сумки-холодильники).
Сперму быков и баранов при 5ºС перевозят в широкогорлых пищевых или пластмассовых термосах. Температура в термосе должна быть не ниже 0ºС. При более низких температурах спермии гибнут. Зимой при транспортировке, если температура воздуха ниже -5ºС, то необходимо утеплить термос. Для перевозки разбавленной спермы быков и баранов и хранения ее при t 10-18ºС используют те же термосы, но заполненные прохладной водой, для поддержания указанной температуры 10-18ºС.
Сперму жеребцов после разбавления транспортируют при 0-5ºС в баночках (50-100 мл) с притертыми пробками, погруженные в термос со льдом.